高壓蒸汽滅菌用途廣,效率高,是微生物學(xué)實驗中常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到1.05kg/cm2時,水蒸氣的溫度升高到121℃,經(jīng)15~30min,可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。
請注意高壓蒸汽滅菌的原理:是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計的。
壓力:100KPa,水蒸氣的溫度:115℃,時間:20min,各種微生物和它們的孢子
壓力:147KPa,水蒸氣的溫度:121℃,時間:15-30min,各種微生物和它們的孢子或芽孢
壓力:156KPa,水蒸氣的溫度:180℃,時間:4h,熱原質(zhì)(Pyrogen):熱原質(zhì)即菌體中的脂多糖
壓力:156KPa,水蒸氣的溫度:250℃,時間:45min,熱原質(zhì)(Pyrogen):熱原質(zhì)即菌體中的脂多糖
壓力:156KPa,水蒸氣的溫度:650℃,時間:1min,熱原質(zhì)(Pyrogen):熱原質(zhì)即菌體中的脂多糖
溫度越高,需時越短,熱穿透能力越強。一般認(rèn)定115℃-121.3℃,對培養(yǎng)基的成分不產(chǎn)生破壞。
高壓蒸汽滅菌使用細(xì)節(jié)
高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi),通過加熱,使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡,然后關(guān)閉排氣閥,繼續(xù)加熱,此時由于蒸氣不能溢出,而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力,從而使沸點增高,得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時,滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否*極為重要,因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓,所以,當(dāng)水蒸汽中含有空氣時,在同一壓力下,含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。所以飽和蒸汽的滅菌更*!
一、高壓滅菌鍋使用前要水加到水位線;
二、將需滅菌的培養(yǎng)基、蒸餾水或其它器皿放入滅菌鍋內(nèi),關(guān)閉鍋蓋,檢查排氣閥、安全閥狀態(tài)(上下排氣閥打開安全閥關(guān)合然后加熱,方便空氣排出,上、下排氣閥都同時處于開啟狀態(tài)待有水蒸汽從上、下閥溢出,此狀態(tài)保持7、8分鐘后,即排出空氣后上排氣閥關(guān)合,下排氣閥調(diào)小,安全閥保持關(guān)合狀態(tài));
三、打開電源,檢查參數(shù)設(shè)置是否正確,然后按下“work”鍵,滅菌鍋開始工作;自動派冷氣,到105℃時,底部排氣閥門自動關(guān)閉,然后壓力開始上升;
四、壓力升至0.15MPa(121℃)時,滅菌鍋再次自動放氣,然后開始記時,一般培養(yǎng)基滅菌20min,蒸餾水滅菌30min;
五、達(dá)到規(guī)定的滅菌時間后,關(guān)閉電源,打開放氣閥緩慢放氣;當(dāng)壓力指針降至0.00MPa時,放氣閥無蒸汽排除時,方可開啟鍋蓋。
六、注意事項
1、汽未放盡前,不得開啟高壓鍋;
2、如果滅菌后的培養(yǎng)基在鍋內(nèi)不及時拿出,需在蒸汽放盡后將鍋蓋打開,切忌將培養(yǎng)基封閉在鍋內(nèi)過夜。
3、壓力表指針在0.05MPa以上時,不能過快放汽,以防止壓力急速下降,液體滾沸,從培養(yǎng)容器中溢出。
4、操作過程,請注意安全,小心燙傷。
在一個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下水的沸點是100攝氏度,壓力越高,與之對應(yīng)壓力下的沸點越高,這里是高壓蒸汽鍋,說明壓力肯定大于一個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓(通常情況下的地表面的大氣壓強就認(rèn)為是一個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓),也就是說高壓蒸汽鍋肯定要超過100攝氏度才能沸騰,才能產(chǎn)生蒸汽。至少要等到水煮沸,排出一分鐘左右的蒸汽后再把安全閥關(guān)閉,這樣可以使高壓蒸汽鍋里的壓力迅速上升,原來沸騰的水因為壓力的快速上升而停止沸騰,壓力大,沸點高,水蒸汽就變成液體水,而放出大量的汽化潛熱,就是高溫高壓的目的,從而達(dá)到殺菌的目的。在同一溫度下,濕熱的殺菌效力比干熱大,其原因有三:
一是濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分,蛋白質(zhì)較易凝固,因蛋白質(zhì)含水量增加,所需凝固溫度降低;
二是濕熱的穿透力比干熱大;
三是濕熱的蒸汽有潛熱存在,每1克水在100℃時,由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱,能迅速提高被滅菌物體的溫度,從而增加滅菌效力。
在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時,滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否*極為重要,因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓,所以,當(dāng)水蒸汽中含有空氣時,在同一壓力下,含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果壓力未降到0時,打開排氣閥,就會因鍋內(nèi)壓力突然下降,使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口,造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染。要100度以上,也就是對應(yīng)壓力下的沸點后才能使水劇烈沸騰,將鍋內(nèi)空氣更多的排除。
高溫滅菌操作中常見錯誤的分析
高溫滅菌是指用熱能殺死微生物。其原理是高溫使原生質(zhì)中的蛋白質(zhì)變性、使酶失活,致使微生物死亡。高溫滅菌主要有高壓蒸汽滅菌法、干熱滅菌法和灼燒滅菌法幾種。如果操作不當(dāng),即達(dá)不到預(yù)期的滅菌效果?,F(xiàn)就常見錯誤分析如下:
1、高壓蒸汽滅菌
蒸汽滅菌屬濕熱滅菌,由于濕熱滅菌有潛能存在,被滅菌物體的溫度比蒸汽的低,蒸汽在其表面凝結(jié)成水,放出潛能,可迅速提高被滅菌物體的溫度。又由于水和水蒸汽比空氣的熱容量大、導(dǎo)熱快、穿透力強,所以,與干熱滅菌相比,滅菌需要的溫度低、時間短。由于高壓蒸汽滅菌法水蒸汽的溫度隨其所受壓力的增加而升高,因而滅菌用的高溫蒸汽都是通過加壓獲得的。
手提式高壓滅菌鍋操作中常見的錯誤有:
(1)排氣不*。在升壓前應(yīng)將鍋內(nèi)冷空氣排凈,因空氣是熱不良導(dǎo)體,若不排凈,冷空氣就會聚集井滯留在滅菌鍋中消毒筒的中下部,圍繞在待滅菌物的周圍。在這種情況下,假若鍋內(nèi)僅排除一半空氣,當(dāng)壓力表指針達(dá)到105Pa時,鍋內(nèi)實際溫度僅能達(dá)到112℃,比要求的121℃低9℃之多,將導(dǎo)致滅菌不*,可能造成大面積染菌。(自動的高壓滅菌鍋上下排氣閥都要打開然后加熱排空氣)
(2)排氣軟管沒有按要求插入滅菌筒的下部,或排氣軟管斷裂、缺失。滅菌鍋內(nèi)的冷空氣是通過排氣軟管排出的,上述情況將造成滅菌筒外的蒸汽直接經(jīng)排氣閥排出鍋外,滅菌鍋內(nèi)的空氣排放受阻。
(3)消毒筒內(nèi)物品堆積太緊、太滿,阻礙蒸汽的流通和熱交換,使容器內(nèi)升溫減慢,造成物體內(nèi)部殺菌不*。
(4)升溫過快。滅菌的時間是以達(dá)到要求溫度后的持續(xù)時間計算的,但溫度的升降過程同樣起到殺菌的作用,升降溫度過快會通過影響總的積溫而影響滅菌效果。另外,升溫過快,特別是使用外源蒸汽的情況下,會造成被滅菌物體內(nèi)部升溫滯后于壓力表指示溫度。
(5)滅菌的物體體積(容量)過大。組織培養(yǎng)中或常規(guī)微生物實驗中,高溫蒸汽滅菌通常要在121℃(即蒸汽壓力為1kg/c㎡或5磅/寸2,或0.105MPa)下保溫15min。這一規(guī)定僅適用于試管、三角瓶中小于200ml容量的。若體積太大,特別是固體培養(yǎng)基,會造成滅菌不*,應(yīng)適當(dāng)延長滅菌時間。
(6)任意延長滅菌時間。規(guī)定的滅菌溫度和時間是經(jīng)過科學(xué)試驗確定的,只要按照正確的滅菌程序是能達(dá)到滅菌目的的。但在實踐中常有人為了“保證*滅菌”而任意延長滅菌時間。這樣忽視了殺菌過程中溫度對培養(yǎng)基成分的破壞作用,是得不償失的。
(7)溫度不穩(wěn)定。滅菌過程中溫度(壓力)忽高忽低,特別是手提式電能滅菌鍋,它沒有控溫裝置,難于控溫。操作者可配置調(diào)壓變壓器,通過調(diào)節(jié)電壓控溫。此外,還常遇到滅菌鍋內(nèi)加水太少(應(yīng)加2~3L);容器內(nèi)裝的溶液量過多(應(yīng)少于2/3);安全閥失靈等問題。
2、干熱滅菌
干熱滅菌指在烘箱160℃溫度下,維持2h,消除物體上的微生物的方法。常見錯誤有:
(1)將滅菌物品(如培養(yǎng)皿)堆摞放置,且堆得過滿、過擠,阻礙空氣流通和熱量的傳遞、交換;
(2)升溫時不打開箱頂通風(fēng)孔,影響箱內(nèi)冷空氣及水汽的排除;
(3)高溫(80℃以上)下開箱取物,熱蒸汽噴出造成燒傷及突然降溫,使玻璃器皿破裂;
(4)溫度過高(180℃以上)造成包裝紙、棉塞焦化,失去防菌或過濾作用;
(5)將不耐熱的槍頭、離心管、試管帽、濾器等塑料制品放入烤箱內(nèi)滅菌,而致熔化。
3、灼燒滅菌
即直接利用火焰將微生物灼燒致死。特點:簡便、迅速、*。主要用于接種工具及器皿的滅菌。如接種杯、鑷子、剪刀、玻棒、瓶口及其封口用的鋁箔的滅菌常見的錯誤有:
(1)接種工具的滅菌范圍不夠,如長度不夠,灼燒時沒有旋轉(zhuǎn)造成內(nèi)外側(cè)滅菌不勻;
(2)接種工具沒有降至常溫即用于接種;
(3)對玻璃器皿灼燒過度,使棉塞、封口膜焦化或熔化。